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糖基化反應條件對豌豆蛋白乳化特性的影響
發(fā)布時(shí)間 : 2022.12.02
豌豆蛋白 低聚木糖 糖基化 乳化活性 乳化穩定性


試驗設計
       采用濕法糖基化方法，將豌豆蛋白與XOS按一定的質(zhì)量比溶解于蒸餾水中，并保持蛋白濃度為1%，磁力攪拌2h混勻，調節pH值為7，于4℃冰箱中放置過(guò)夜，使其充分水合。將樣品放置在75℃水浴鍋中反應90min，取出在冰水中冷卻5min，以終止反應，得到糖基化產(chǎn)物。
       測定糖基化產(chǎn)物的乳化特性：取15mL糖基化樣品溶液，加入5mL大豆油混合后進(jìn)行剪切（室溫（25℃）、12000r/min、2min）處理。剪切處理后分別在0、10min從底部取樣50μL，加入5mL0.1%SDS，測定500nm處的吸光值，以SDS溶液為空白。乳化特性以乳化活力指數（EAI）表示，計算公式如下。

       式中：EAI是每克蛋白質(zhì)的乳化面積，m2/g；A500為500nm處的吸光值；N是稀釋倍數；Φ是體系中油相所占體積分數；C是蛋白質(zhì)的濃度，g/mL；L是比色皿光徑，1cm。
       乳化穩定性用乳化穩定指數(ESI)表示，計算公式如下。
       式中：A0為0min的吸光值；A10為10min的吸光值。
       調節溶液pH值分別為7.0，反應溫度為70℃，控制糖基化反應時(shí)間為90min，調控豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比分別為1︰1、2︰1、3︰1、4︰1，測定不同豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比下糖基化產(chǎn)物的乳化特性。調節溶液pH值分別為7.0，控制豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比為2︰1，糖基化反應時(shí)間為90min，調控反應溫度分別為70、80、90、100℃，測定不同反應溫度下糖基化產(chǎn)物的乳化特性。調節溶液pH值分別為7.0，控制豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比為2︰1，，反應溫度為80℃，調控糖基化反應時(shí)間分別為30、60、90、120min，測定不同反應時(shí)間下糖基化產(chǎn)物的乳化特性。
       在單因素試驗的基礎上，選擇反應溫度、反應時(shí)間、豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比3個(gè)因素為自變量，以產(chǎn)物的乳化特性為響應值設計試驗，研究各自變量及其交互作用對豌豆蛋白乳化特性的影響，進(jìn)一步優(yōu)化XOS糖基化豌豆蛋白改性工藝的最佳參數。設計類(lèi)型為三因素三水平共17個(gè)試驗點(diǎn)，其中5個(gè)為中心試驗，12個(gè)為析因試驗，對試驗結果進(jìn)行回歸擬合及方差分析，試驗因素水平如表1所示。采用SPSS20、Excel軟件對試驗數據進(jìn)行處理、作圖及顯著(zhù)性分析，顯著(zhù)性水平設為0.05。采用DesignExpert8.0.6軟件對響應面數據進(jìn)行分析。

試驗結果
（1）豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比對豌豆蛋白乳化特性的影響
       在豌豆蛋白濃度為1%，反應溫度為70℃，反應時(shí)間為90min時(shí)，豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比對糖基化反應過(guò)程中豌豆蛋白乳化特性的影響如圖1所示。


       由圖1可知，隨著(zhù)豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比的增加，豌豆蛋白糖基化產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩定性均呈現先上升后下降的趨勢。在一定的豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比下，溶液黏性可使糖分子與蛋白質(zhì)分子接觸機會(huì )增大，糖基化反應順利進(jìn)行；XOS附著(zhù)在蛋白質(zhì)表面增加了空間位阻，因此油滴不易聚集和凝結，從而表現出糖基化產(chǎn)物乳化活性和乳化穩定性提高。當糖分子過(guò)多，溶液黏性隨之增加，反而不利于糖基化反應進(jìn)行，導致乳化特性較差?？梢?jiàn)適當的蛋白質(zhì)與糖的質(zhì)量比有利于獲得乳化特性較好的糖基化產(chǎn)物。因此，確定豌豆蛋白與XOS的質(zhì)量比為2:1，此時(shí)糖基化產(chǎn)物具有高的乳化特性，乳化活性和乳化穩定性分別為10.34m2/g和61.75%。
（2）反應溫度對豌豆蛋白乳化特性的影響
       在豌豆蛋白濃度為1%，豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比為2︰1，反應時(shí)間為90min時(shí)，反應溫度對糖基化反應過(guò)程中豌豆蛋白乳化特性的影響見(jiàn)圖2。
       由圖2可知，整體上，隨著(zhù)反應溫度的升高，糖基化產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩定性呈現先升高后下降的趨勢。當反應溫度在80℃時(shí)，糖基化產(chǎn)物具有較好的乳化特性(乳化活性12.3m2/g，乳化穩定性70.15%)，不同反應溫度的乳化穩定性無(wú)顯著(zhù)性差異，故以乳化活性最高為最佳反應溫度。反應溫度是影響糖基化反應進(jìn)程的一個(gè)重要指標，適當的反應溫度，使蛋白質(zhì)變性伸展，多肽鏈被解聚成小分子肽和游離氨基酸，加快了糖與蛋白質(zhì)的結合，使乳化活性升高；溫度過(guò)高時(shí)，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，不利于糖和蛋白質(zhì)的結合。
（3）反應時(shí)間對豌豆蛋白乳化特性的影響
       當豌豆蛋白濃度為1%，豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比為2︰1，反應溫度為70℃時(shí)，反應時(shí)間對糖基化反應過(guò)程中豌豆蛋白乳化特性的影響如圖3所示。
       由圖3可知，在0～120min的反應時(shí)間段，隨著(zhù)反應時(shí)間的延長(cháng)，乳化活性和乳化穩定性均呈現先增加后降低的趨勢。這是由于隨著(zhù)反應時(shí)間的延長(cháng)，糖和蛋白質(zhì)不斷結合，乳化活性隨之提高，而反應時(shí)間過(guò)長(cháng)，更多的親水性糖分子附著(zhù)在豌豆蛋白上，這會(huì )相應地降低乳化活性。當反應時(shí)間為60min時(shí)，糖基化產(chǎn)物具有較好的乳化活性，乳化穩定性無(wú)顯著(zhù)變化，此時(shí)乳化活性為11.83m2/g；乳化穩定性為56.20%。
（4）最佳反應條件的確定
       在反應溫度（A）、反應時(shí)間（B）、豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比（C）單因素研究的基礎上，以乳化特性（乳化活性和乳化穩定性）為響應指標，采用Box-Benhnken響應面優(yōu)化設計方案，具體設計方案及試驗結果見(jiàn)表2。同時(shí)對結果進(jìn)行多元回歸分析，結果如表3和表4所示。

       以溫度（A）、時(shí)間（B）、豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比（C）為自變量，通過(guò)對優(yōu)化結果進(jìn)行多元回歸分析得到乳化活性（Y1）、乳化穩定性（Y2）和反應條件之間的二次多項式回歸方程分別為Y1=-23.56704+0.69245A+0.10712B+4.84350C-0.000305AB-0.006AC-0.0177BC-0.004315A2-0.0003064B2-0.651C2，R2=0.9621；Y2=-65.16468+2.26480A+ 0.72166B+0.72166C-0.0045625AB+0.14587AC-0.11115BC-0.014364A2-0.0007863 B2-2.93575C2，R2=0.9677。其中，由模型擬合F檢驗值可知，乳化活性F=19.72，P值=0.0004<0.01，乳化穩定性F=23.29，P值=0.0002<0.01，說(shuō)明該模型擬合性較好，達到顯著(zhù)水平；同時(shí)，失擬項：乳化活性F=3.31，P值=0.1391>0.05，乳化穩定性F=1.67，P值=0.3095>0.05，模型失擬性檢驗不顯著(zhù)。去掉對乳化活性影響不顯著(zhù)的交互因素AB、AC后模型R2=0.9485、調整R2=0.9085、預測R2=0.7728、變異系數=4.02。對于乳化穩定性模型R2=0.9677、調整R2=0.9261、預測R2=0.6901、變異系數=2.93。結果表明該模型擬合度好，可以很好地對響應值（乳化特性）進(jìn)行預測。

       由表3和表4得到的回歸方程系數顯著(zhù)性檢驗可得，選取的反應溫度、反應時(shí)間及豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比3個(gè)因素對豌豆蛋白糖基化復合物的乳化特性有重要影響。對一次項回歸系數的絕對值大小排序，可得乳化活性中3個(gè)因素的影響順序為C＞A＞B，乳化穩定性3個(gè)因素的影響順序為C＞B＞A。此外，交互作用中，一次項A、B、C，交互項BC，二次交互項A2、B2對改性豌豆蛋白乳化活性影響極顯著(zhù)，二次項C2影響顯著(zhù)。一次項B、C，交互項AB、AC、BC，二次交互項A2、、C2對改性豌豆蛋白乳化穩定性影響極顯著(zhù)，二次項B2影響顯著(zhù)。這說(shuō)明各因素對糖基化產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩定性的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。
       為進(jìn)一步研究各因素之間交互作用對豌豆蛋白乳化特性的影響，用Design-Expert8.0.6進(jìn)行各因素之間的交互作用響應面分析，結果如圖4和圖5所示。
       圖4直觀(guān)反映出蛋白-糖比例和反應時(shí)間對豌豆蛋白乳化活性的影響，當豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比固定時(shí)，乳化活性隨著(zhù)反應時(shí)間的增加呈先升高后降低的趨勢；圖5直觀(guān)反映出各影響因素交互作用對乳化穩定性的影響，當豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比不變時(shí)，乳化穩定性隨著(zhù)反應溫度的增加呈先升高后降低的趨勢。
（5）最佳工藝條件驗證
       試驗表明，豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比、反應溫度、反應時(shí)間均可影響糖基化反應進(jìn)程，進(jìn)而影響糖基化產(chǎn)物乳化特性的變化。采用Design-Expert8.0.6進(jìn)行模型預測，預測工藝條件為反應溫度74.63℃、反應時(shí)間93.65min、豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比1.86︰1，預測改性豌豆蛋白的乳化活性為12.13m2/g、乳化穩定性為60.44%。根據實(shí)際試驗條件，在反應溫度75℃、反應時(shí)間90min、豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比2︰1條件下測得乳化活性為12.32m2/g、乳化穩定性為59.64%，調整后預測改性豌豆蛋白的乳化活性為12.19m2/g、乳化穩定性為60.16%?？梢?jiàn)，實(shí)際值與預測理論值接近，說(shuō)明此模型優(yōu)化結果可靠。
試驗結論
       本試驗以豌豆蛋白與XOS為原料，采用濕法糖基化方法制備豌豆蛋白-XOS復合物。通過(guò)單因素試驗和響應面法建立糖基化復合物制備條件（豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比、反應溫度、反應時(shí)間）的數學(xué)模型，根據回歸方程分析及預測模型，得到最佳制備工藝條件。整體上，模型擬合度好，可以很好地對反應過(guò)程中豌豆蛋白乳化特性進(jìn)行預測。這3個(gè)因素對豌豆蛋白乳化活性影響大小為豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比＞反應溫度＞反應時(shí)間；對乳化穩定性影響大小為蛋白-糖比例＞反應時(shí)間＞反應溫度。最佳工藝條件為反應溫度75℃、反應時(shí)間90min、豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比2︰1，測得乳化活性為12.32m2/g、乳化穩定性為59.64%。該研究將為豌豆蛋白在乳液體系中的應用奠定基礎。




參考資料：

馬露燕,郭興鳳,朱婷偉,田亞?wèn)|,段曉杰.糖基化反應條件對豌豆蛋白乳化特性的影響[J/OL].食品研究與開(kāi)發(fā):1-10[2022-10-21].http://kns.cnki.net/kcms/detail/12.1231.ts.20221009.1716.004.html